PEI轉(zhuǎn)染的原理與使用操作方法

PEI轉(zhuǎn)染是目前工業(yè)化、大規(guī)模瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)重組蛋白或病毒載體領(lǐng)域使用廣泛的基因載體和轉(zhuǎn)染試劑。PEI是一種帶有高電荷陽(yáng)離子的多聚物，極易與帶負(fù)電荷的DNA分子結(jié)合，形成復(fù)合物。在HEK293和CHO等細(xì)胞中，采用PEI轉(zhuǎn)染法能夠獲得較高的轉(zhuǎn)染效率，尤其適用于大規(guī)模的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)實(shí)驗(yàn)。相較于磷酸鈣法，PEI轉(zhuǎn)染試劑制備更加簡(jiǎn)便，適用于更多種類(lèi)的細(xì)胞，并且具有更高的性?xún)r(jià)比。與脂質(zhì)體等轉(zhuǎn)染試劑相比，PEI轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞的毒性較小。對(duì)于難以進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞而言，利用PEI進(jìn)行慢病毒包裝也非常方便，滿(mǎn)足了大多數(shù)細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的需求。

PEI轉(zhuǎn)染原理

PEI 能將 DNA 包裹成帶正電荷的微粒，這些微粒可以黏合到帶有負(fù)電荷的細(xì)胞表面殘基，并通過(guò)胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞。一旦進(jìn)入細(xì)胞，胺的質(zhì)子化導(dǎo)致反離子大量涌入以及滲透勢(shì)降低，在低pH環(huán)境中實(shí)現(xiàn)DNA胞內(nèi)釋放。最被接受的觀(guān)點(diǎn)是PEI上未質(zhì)子化的胺可以在與膜結(jié)合的細(xì)胞器（如溶酶體）中吸收氫離子，這將導(dǎo)致更多氫離子的流入，誘發(fā)滲透溶脹。而質(zhì)子化胺之間的排斥引起PEI構(gòu)象的改變，上述變化導(dǎo)致的滲透膨脹使囊泡釋放聚合物與 DNA 形成的復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。復(fù)合物拆解后，DNA 能自由的融合到細(xì)胞核中。

PEI轉(zhuǎn)染操作方法

PEI轉(zhuǎn)染試劑使用比較方便，對(duì)血清與抗生素兼容性強(qiáng)。具體操作步驟范例如下（以HEK293細(xì)胞為例）

① 轉(zhuǎn)染前，確保細(xì)胞存活率大于95%，活細(xì)胞密度在(1.5~2.0)×10^6 cells/mL之間；

② 將活細(xì)胞密度稀釋至1.05×106 cells/mL；

③ 將pDNA和1 mg/mL Bestop™PEI線(xiàn)性轉(zhuǎn)染試劑顛倒數(shù)次，混勻；

④ 每毫升待轉(zhuǎn)染培養(yǎng)物轉(zhuǎn)1μg pDNA到一個(gè)干凈的小瓶中。用新鮮培養(yǎng)基稀釋至20μg/mL（5%最終培養(yǎng)體積）。

⑤ 每毫升待轉(zhuǎn)染培養(yǎng)物轉(zhuǎn)3μL 1 mg/mL Bestop™PEI線(xiàn)性轉(zhuǎn)染試劑至干凈的小瓶中。用培養(yǎng)基稀釋至60 μg/mL(5%最終培養(yǎng)體積)。

⑥ 將稀釋的pDNA和Bestop™PEI線(xiàn)性轉(zhuǎn)染試劑混合。顛倒幾次，在室溫下靜置10分鐘。使用前將密封的容器輕輕顛倒一次。

⑦ 每90 mL培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染10 mL pDNA/PEI混合物。在混合的同時(shí)逐漸將混合物加入到培養(yǎng)基中，孵育細(xì)胞。

⑧ 轉(zhuǎn)染后：如果使用增強(qiáng)劑或補(bǔ)充劑，可以在轉(zhuǎn)染后6小時(shí)的任何時(shí)間添加。傳代培養(yǎng)也可以在6小時(shí)后進(jìn)行。

如果使用GFP對(duì)照，48小時(shí)后應(yīng)觀(guān)察到轉(zhuǎn)染率超過(guò)70%。對(duì)于優(yōu)化過(guò)的方法，80%以上的轉(zhuǎn)染率是合理的。

PEI使用常見(jiàn)問(wèn)題

Q1：多配置一點(diǎn)母液凍存起來(lái)是否會(huì)延長(zhǎng)效期？

A：不建議凍存，儲(chǔ)存液2-8℃保存3個(gè)月使用是沒(méi)問(wèn)題的。

Q2：轉(zhuǎn)染后是否需要換液？

A：不需要換液，也可在轉(zhuǎn)染后6-8h觀(guān)察細(xì)胞狀態(tài)后，決定是否有必要進(jìn)行換液。

Q3：轉(zhuǎn)染的時(shí)候是否需要無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)？

A：制備復(fù)合物的時(shí)候需要使用無(wú)血清培養(yǎng)基，而加入細(xì)胞中的時(shí)候不要求無(wú)血清培養(yǎng)。