慢病毒載體在動(dòng)物疾病模型構(gòu)建中應(yīng)用場(chǎng)景（慢病毒的體內(nèi)應(yīng)用）

科學(xué)家們?cè)谏钊胩骄考膊〉陌l(fā)生機(jī)制過(guò)程中，動(dòng)物模型的建立起到了至關(guān)重要的作用。通過(guò)對(duì)動(dòng)物模型進(jìn)行疾病模擬或基因突變，可以模擬人類疾病的發(fā)病過(guò)程，從而揭示疾病的病理生理機(jī)制、分子機(jī)制和遺傳機(jī)制。同時(shí)，動(dòng)物模型也可以用于評(píng)估潛在藥物的療效和安全性，為新藥的研發(fā)提供重要參考。通過(guò)對(duì)動(dòng)物模型進(jìn)行藥物治療試驗(yàn)，可以評(píng)估藥物對(duì)疾病的治療效果、劑量效應(yīng)、藥物代謝和毒性反應(yīng)等，為臨床前藥物篩選和開(kāi)發(fā)提供重要參考依據(jù)。

通過(guò)慢病毒介導(dǎo)的基因傳遞，可以構(gòu)建具有特定基因型的動(dòng)物模型，如基因敲除、過(guò)表達(dá)或突變等，也可以構(gòu)建疾病模型，模擬人類疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程，用于疾病機(jī)制研究和藥物篩選。慢病毒載體在動(dòng)物疾病模型構(gòu)建中有多種應(yīng)用場(chǎng)景，今天就來(lái)和小編一起探索一下慢病毒的體內(nèi)應(yīng)用吧。

一、瘤內(nèi)注射

?文章標(biāo)題：METTL3-Mediated LINC00475 AlternativeSplicing Promotes Glioma Progression byInducing Mitochondrial Fission
?發(fā)表期刊：Research (Washington, D.C.)
?作者單位：廣州醫(yī)科大學(xué)

線粒體分裂促進(jìn)膠質(zhì)瘤的進(jìn)展，但lncRNAs在線粒體分裂中的功能和調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本文中，作者發(fā)現(xiàn)與正常腦組織相比，LINC00475被證實(shí)在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中過(guò)度表達(dá)，并且發(fā)生可變剪接的頻率更高，預(yù)后更差。體外和動(dòng)物腫瘤形成實(shí)驗(yàn)表明，LINC00475-S對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、自噬和線粒體分裂的影響明顯強(qiáng)于LINC00475。從機(jī)制上講，METTL3 通過(guò)m6A修飾通過(guò)剪接LINC00475誘導(dǎo)LINC00475-S的產(chǎn)生，隨后通過(guò)抑制MIF的表達(dá)促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的線粒體分裂。Pull-down聯(lián)合LC/MS和RIP發(fā)現(xiàn)m6A識(shí)別蛋白HNRNPH1結(jié)合LINC00475的GYR和GY結(jié)構(gòu)域并促進(jìn)LINC00475剪接。METTL3以m6A 依賴性方式促進(jìn)HNRNPH1與LINC00475結(jié)合，從而誘導(dǎo) LINC00475-S的產(chǎn)生。METTL3 促進(jìn)HNRNPH1介導(dǎo)的LINC00475的可變剪接，通過(guò)誘導(dǎo)線粒體分裂促進(jìn)膠質(zhì)瘤進(jìn)展。靶向LINC00475的可變剪接和m6A編輯可以作為對(duì)抗神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療策略。

圖1. 過(guò)表達(dá)LINC00475-S時(shí)，U251致瘤潛力增強(qiáng)

☆ 作者利用慢病毒載體，通過(guò)瘤內(nèi)注射（5.0E+06 TU/只，2周1次）在腫瘤組織中過(guò)表達(dá)LINC00475和LINC00475-S。

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二、氣管內(nèi)注射

?文章標(biāo)題：A novel protein RASON encoded by a lncRNA controls  oncogenic RAS signaling in KRAS mutant cancers
?發(fā)表期刊：Cell Research
?作者單位：南京大學(xué)

LSL-KrasG12D; Trp53R172H/+ (KP小鼠)肺癌模型是一種通常用于研究Kras驅(qū)動(dòng)的腫瘤發(fā)生的遺傳小鼠模型。KrasG12D是人類腫瘤中常見(jiàn)的Kras基因的活化突變體，Trp53R172H是p53基因的突變體。分別在這兩個(gè)基因編碼區(qū)和啟動(dòng)子之間插入loxp-Stop-loxp終止序列，這兩個(gè)基因在沒(méi)有Cre重組酶的條件下不表達(dá)突變蛋白；當(dāng)與組織特異性表達(dá)的Cre交配后，可導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄終止序列l(wèi)oxp-Stop-loxp缺失進(jìn)而表達(dá)致癌蛋白。

本文中，作者通過(guò)氣管內(nèi)注射含有Cre、Cas9和Rason sgRNA的慢病毒構(gòu)建體，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了Rason的敲除和肺中Kras/p53等位基因的激活。通過(guò)mircoCT對(duì)肺部腫瘤的發(fā)生率及腫瘤大小進(jìn)行監(jiān)測(cè)，結(jié)果顯示Rason敲除顯著抑制KP小鼠肺部腫瘤的形成，并顯著延長(zhǎng)小鼠的存活期。以上結(jié)果提示了Kras突變腫瘤中Rason促腫瘤功能的共同機(jī)制。

圖2. Rason敲除顯著抑制KP小鼠肺部腫瘤的形成

☆ 作者利用含有Cre、Cas9和Rason sgRNA的慢病毒載體，通過(guò)氣管內(nèi)注射（1.0E+05 TU/只）同時(shí)實(shí)現(xiàn)Rason的敲除和肺中Kras/p53等位基因的激活。

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三、鞘內(nèi)注射

?文章標(biāo)題：Activation of GDNF-ERK-Runx1 signaling contributes to P2X3R gene transcription and bone cancer pain
?發(fā)表期刊：iScience
?作者單位：北京大學(xué)

骨癌疼痛是骨轉(zhuǎn)移癌癥患者的常見(jiàn)癥狀，其潛在機(jī)制尚不清楚。本文中作者報(bào)道了 Runx1直接上調(diào)PC12細(xì)胞中P2X3受體（P2X3R）基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。敲低背根神經(jīng)節(jié)（DRG）神經(jīng)元中的Runx1抑制P2X3R的功能性上調(diào)，減弱荷瘤大鼠的神經(jīng)元過(guò)度興奮和疼痛超敏反應(yīng)；而過(guò)表達(dá)Runx1促進(jìn)DRG神經(jīng)元中的P2X3R基因轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)了naive大鼠的神經(jīng)元過(guò)度興奮和疼痛超敏反應(yīng)。GDNF-GFRα1-Ret-ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的激活是DRG神經(jīng)元中Runx1介導(dǎo)的P2X3R基因轉(zhuǎn)錄所必需的，并有助于荷瘤大鼠的神經(jīng)元過(guò)度興奮和疼痛超敏反應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)表明，由GDNF-GFRα1-Ret-ERK信號(hào)激活引起的Runx1介導(dǎo)的P2X3R基因轉(zhuǎn)錄有助于DRG神經(jīng)元的致敏和骨癌疼痛的發(fā)病機(jī)制。作者的研究結(jié)果確定了一種潛在的靶向機(jī)制，可能導(dǎo)致癌癥患者的骨轉(zhuǎn)移相關(guān)疼痛。

圖3. 過(guò)表達(dá)DRG神經(jīng)元中的Runx1，促進(jìn)P2X3R基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)

☆ 作者利用慢病毒載體，通過(guò)鞘內(nèi)注射（5.0 E+08 TU/mL，20 ul）在DRG神經(jīng)元中過(guò)表達(dá)Runx1，并在病毒注射后14天獲得DRG組織。

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四、玻璃體腔注射

?文章標(biāo)題：ALKBH5-Mediated m6A Modification of A20 Regulates Microglia Polarization in Diabetic Retinopathy
?發(fā)表期刊：Frontiers in Immunology
?作者單位：中山大學(xué)

本文中，作者發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠的視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞M1極化率較高，M2極化率較低。隨著葡萄糖濃度的增加，小膠質(zhì)細(xì)胞傾向于極化為M1型。通過(guò)RNA測(cè)序顯示，葡萄糖處理的小膠質(zhì)細(xì)胞顯示出差異表達(dá)的基因譜，該譜富集在各種炎癥類別和通路中。葡萄糖處理后小膠質(zhì)細(xì)胞中A20表達(dá)較低，證明其負(fù)向調(diào)節(jié)M1極化。此外，玻璃體腔注射A20過(guò)表達(dá)慢病毒（OE-A20）糾正了糖尿病大鼠增強(qiáng)的M1視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞極化。在葡萄糖處理的小膠質(zhì)細(xì)胞中m6A去甲基化酶ALKBH5介導(dǎo)增加m6A修飾及加速A20降解。本研究不僅為糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機(jī)制提供了新的視角，而且為糖尿病視網(wǎng)膜病變的診斷和治療提供了新的視角。

圖4. 玻璃體腔注射A20過(guò)表達(dá)慢病毒可糾正糖尿病大鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞增強(qiáng)的M1極化

☆ 作者利用慢病毒載體，通過(guò)玻璃體腔注射(1.0E+09 TU,10 ul)在眼內(nèi)過(guò)表達(dá)A20。

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五、腹股溝淋巴結(jié)注射

?文章標(biāo)題：Fibroblastic reticular cells in lymph node potentiate white adipose tissue beiging through neuro-immune crosstalk in male mice
?發(fā)表期刊：Nature Communications
?作者單位：香港大學(xué)

淋巴結(jié)（LN）通常嵌在代謝活躍的白色脂肪組織（WAT）中，而它們的功能關(guān)系仍然模糊不清，本文中，作者發(fā)現(xiàn)腹股溝 LN（iLN）中的成纖維細(xì)胞網(wǎng)狀細(xì)胞（FRC）皮下 脂肪組織（scWAT）寒冷誘導(dǎo)的米色化反應(yīng)和產(chǎn)熱IL-33的主要來(lái)源。從機(jī)制上講，冷增強(qiáng)的交感神經(jīng)流出到iLN激活FRC中的β1和β2腎上腺素能受體（AR）信號(hào)傳導(dǎo)，以促進(jìn)IL-33釋放到iLN周圍的scWAT中。其中IL-33激活2型免疫反應(yīng)以增強(qiáng)米色脂肪細(xì)胞的生物發(fā)生。通過(guò)選擇性消融 FRC中的IL-33或β1和β2-AR或iLN的交感神經(jīng)去神經(jīng)支配來(lái)消除冷誘導(dǎo)的scWAT 米色化反應(yīng)，而IL-33的補(bǔ)充可逆轉(zhuǎn)iLN缺陷小鼠中受損的冷誘導(dǎo)的米色化反應(yīng)。綜上所述，本研究揭示了iLN中FRC在介導(dǎo)神經(jīng)免疫相互作用以維持能量穩(wěn)態(tài)方面的意想不到的作用。

圖5. 腹股溝淋巴結(jié)內(nèi)注射慢病毒特異性敲除FRC中的IL-33

☆ 作者利用慢病毒載體，在IL-33fl/fl小鼠腹股溝淋巴結(jié)內(nèi)注射（7.5E+06 TU/只）含有特異性啟動(dòng)子Ccl19和Cre的慢病毒，實(shí)現(xiàn)iLN中FRC 細(xì)胞IL-33的特異性敲除。

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六、活體成像

?文章標(biāo)題：Hypoxia-induced circRNF13 promotes the progression and glycolysis of pancreatic cancer
?發(fā)表期刊：Experimental & Molecular Medicine
?作者單位：上海交通大學(xué)

胰腺癌（PC）是最惡性的腫瘤之一?？焖龠M(jìn)展和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是患者死亡的主要原因。缺氧是多種癌癥的標(biāo)志，與腫瘤生物學(xué)有關(guān)。然而，關(guān)于circRNA在糖酵解和缺氧介導(dǎo)的PC進(jìn)展中的作用知之甚少。在這里，作者使用RNA測(cè)序分析了缺氧相關(guān)circRNA的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)了一種稱為circRNF13的獨(dú)tecircRNA在PC組織中上調(diào)，這可能是一個(gè)潛在的預(yù)后指標(biāo)。HIF-1α和EIF4A3參與調(diào)節(jié)circRNF13的生物發(fā)生。此外，circRNF13被驗(yàn)證對(duì)細(xì)胞增殖、血管生成、侵襲和糖酵解具有刺激作用。重要的是，作者發(fā)現(xiàn)circRNF13 通過(guò)充當(dāng)miR-654-3p海綿來(lái)提高PDK3水平，從而促進(jìn)PC惡性過(guò)程。以上研究結(jié)果表明，由HIF-1α和EIF4A3介導(dǎo)的缺氧誘導(dǎo)的circRNF13促進(jìn)了PC的腫瘤進(jìn)展和糖酵解，表明circRNF13作為PC的預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的潛力。

圖6. circRNF13可能作為致癌基因促進(jìn)胰腺癌的轉(zhuǎn)移

☆ 作者通過(guò)尾靜脈分別注射經(jīng)慢病毒構(gòu)建的過(guò)表達(dá)circRNF13序列和Luciferase編碼序列以及干擾circRNF13序列和Luciferase編碼序列的人胰腺癌細(xì)胞，每2周進(jìn)行一次生物發(fā)光體內(nèi)成像檢測(cè)，觀察體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移情況。

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