PEI細(xì)胞轉(zhuǎn)染液使用方法

使用方法

1. 接種細(xì)胞：用膠原酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)（不建議用胰酶）。轉(zhuǎn)染前18-24小時(shí)進(jìn)行細(xì)胞的鋪板，以便在轉(zhuǎn)染時(shí)，貼壁細(xì)胞的密度大約在80%左右。注：培養(yǎng)液中的血清和抗生素不影響轉(zhuǎn)染效率。

    2.   準(zhǔn)備 EZ Trans-DNA 復(fù)合物

        （1）轉(zhuǎn)染前將所有試劑置于室溫10分鐘。下面，以轉(zhuǎn)染24孔板培養(yǎng)皿為例，說(shuō)明轉(zhuǎn)染的具體方法（如果在別的培養(yǎng)器皿中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，各試劑建議使用量見(jiàn)表1.：

       （2）將1 μg 質(zhì)粒DNA稀釋到40 μL無(wú)血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，用移液槍吹吸3-4次。

       （3）將3 μL EZ Trans轉(zhuǎn)染試劑稀釋到40 μL無(wú)血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，用移液槍吹吸3-4次。

      注：無(wú)血清的高糖DMEM培養(yǎng)基是稀釋液，不能使用含血清的培養(yǎng)基（包括Opti-MEM）進(jìn)行DNA和EZ Trans轉(zhuǎn)染試劑的稀釋！因?yàn)镋Z Trans-DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物的形成過(guò)程不能含有血清。

       （4）將稀釋好的EZ Trans轉(zhuǎn)染試劑一次性全部加入到已稀釋好的質(zhì)粒DNA中，立即用移液槍吹吸3-4次。

     注：此混合的順序不能反向進(jìn)行！

      （5）室溫放置10-15分鐘，以形成EZ Trans-DNA復(fù)合物。

表1：不同培養(yǎng)體積對(duì)應(yīng)的待轉(zhuǎn)DNA、EZ Trans、稀釋液用量

3.   轉(zhuǎn)染細(xì)胞

1. 將上述80 μL EZ Trans-DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物均勻滴入到含細(xì)胞的培養(yǎng)皿中。輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿或輕微渦旋，讓EZ Trans-DNA復(fù)合物分散均勻。
2. 在 CO₂培養(yǎng)箱中 37℃下孵育細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后12-18小時(shí)，去除含EZ Trans-DNA復(fù)合物的培養(yǎng)液。（若細(xì)胞形態(tài)欠佳，可在轉(zhuǎn)染3-5h后，添加1/2體積的包含30%血清的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，在轉(zhuǎn)染12-18小時(shí)后*去除含EZ Trans-DNA復(fù)合物的培養(yǎng)液，用含血清和抗生素的新鮮培養(yǎng)液。）
3. 轉(zhuǎn)染后zui快7h即可檢測(cè)到轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)，可根據(jù)需要在24-48小時(shí)內(nèi)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

      注：篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，可在上述操作后（轉(zhuǎn)染細(xì)胞24小時(shí)后），將細(xì)胞傳代至新鮮的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中（將細(xì)胞稀釋10倍以上），在 CO₂培養(yǎng)箱中 37℃孵育過(guò)夜。在有轉(zhuǎn)染抗性基因相匹配的藥物篩選條件下，約 1～2周可篩選到耐藥性克隆，在這期間需經(jīng)常更換含篩選藥物的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。

運(yùn)輸與保存方法

       常溫運(yùn)輸，4℃保存，保質(zhì)期12個(gè)月。

使用注意事項(xiàng)

       質(zhì)粒質(zhì)量：請(qǐng)務(wù)必使用高質(zhì)量轉(zhuǎn)染級(jí)無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒。通過(guò)260 nm光吸收測(cè)定DNA 濃度，260nm / 280nm比值確定 DNA 純度（比值應(yīng)該在1.8～2.0的范圍之內(nèi)）。如有可能，請(qǐng)通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)粒的完整性。

      細(xì)胞條件：使用適當(dāng)保存和經(jīng)常傳代的健康細(xì)胞。確保培養(yǎng)基沒(méi)有被細(xì)菌、真菌或支原體污染。如果細(xì)胞是近期復(fù)蘇的液氮凍存細(xì)胞，請(qǐng)?jiān)谵D(zhuǎn)染前至少傳代兩次。建議使用GIBCO或者李記生物的胎牛血清培養(yǎng)細(xì)胞。

特別提醒

1. 對(duì)于某些類型的細(xì)胞如 HEK-293、HEK293T、NIH/3T3 和 COS 細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染前兩天鋪板可顯著提高轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)水平。如果選擇轉(zhuǎn)染前兩天鋪板，可適當(dāng)降低鋪板密度，以確保轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞的匯合度仍為70～80%。

2. 對(duì)于接觸抑制敏感的細(xì)胞，可適當(dāng)降低鋪板密度。

3. 即使在有蛋白（如10%的血清）存在的情況下，DNA-PEI復(fù)合物仍能轉(zhuǎn)染細(xì)胞，但是DNA-PEI復(fù)合物必須在無(wú)蛋白存在的條件下形成。

4. 對(duì)大多數(shù)細(xì)胞來(lái)而言，每 1μg DNA 使用 3.0 μL EZ Trans試劑都能獲得較高轉(zhuǎn)染效率。使用者也可嘗試每 1 μg DNA使用 1～4μL體積線性PEI轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行優(yōu)化。

EZ Trans轉(zhuǎn)染液用于不同細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)用量參考（以96孔板為例）