cy染料小動(dòng)物活體成像操作流程

吲哚花菁綠(ICG，indocyanine green)是經(jīng)過(guò)FDA認(rèn)證的菁染料，出于安全考慮，后期應(yīng)用于活體（人、動(dòng)物、細(xì)胞）的染料在結(jié)構(gòu)上都和ICG有相似或相近之處。cy系列染料是Amersham公司（目前為GE公司）zui初開(kāi)發(fā)的染料體系，它的橋環(huán)由苯并吲哚變?yōu)檫胚岘h(huán)，并在吲哚的苯環(huán)上對(duì)稱地引入硫酸根基團(tuán)，水溶性得到很大改善，分子量降低后對(duì)大分子的親和力有所增加。cy系列菁染料多帶有羥基琥珀酰亞胺活性酯(NHS ester)、異硫氰酸酯(NCS)等活性基團(tuán)，可與蛋白質(zhì)、多肽、DNA或其他生物分子中的羥基、氨基或巰基以化學(xué)鍵的方式鍵合，表征生物分子的特性，形成具有生物功能的標(biāo)記衍生物，廣泛被用于抗體、多肽、小分子等多種熒光探針的合成中，可以說(shuō)是目前使用的一類近紅外染料。cy染料應(yīng)選擇GE、李記生物等公司產(chǎn)品，化工企業(yè)提供的cy染料產(chǎn)品，一般不作為活體成像使用。

一、Cy染料在活體成像的應(yīng)用領(lǐng)域

1. 標(biāo)記特異性抗體

在CY菁染料標(biāo)記蛋白的研究中，除了牛血清白蛋白以外zui先開(kāi)始涉及的功能性物質(zhì)是抗體。從起初與IgG結(jié)合，用熒光光纖免疫傳感器(FFOI，fluorescent fiber-optic immunosensor)考察抗原抗體反應(yīng)，到現(xiàn)在連接特異性的單克隆抗體片段，對(duì)動(dòng)物全身進(jìn)行免疫熒光顯影，分析片段在體內(nèi)的分布代謝情況。分析cy-抗體復(fù)合物在不同時(shí)間不同器官中的熒光強(qiáng)度變化，可對(duì)抗體的靶向性、清除率等有更直觀的評(píng)價(jià)。不過(guò)，染料抗體衍生物在降低背景噪音和非特異性吸附方面還有待進(jìn)一步完善。

2. 標(biāo)記特異性多肽(Conjugating to peptides)

在腫瘤診斷和治療中，與菁染料衍生物結(jié)合的多肽主要有兩種：其一是針對(duì)腫瘤表面過(guò)量表達(dá)的受體；另一種則針對(duì)腫瘤相關(guān)酶類。前者的報(bào)道很多，如生長(zhǎng)激素抑制素、表皮生長(zhǎng)因子，甚至一些特殊設(shè)計(jì)過(guò)的短肽，都可以被用來(lái)靶向結(jié)合腫瘤，現(xiàn)在更趨向于一些只有十幾個(gè)氨基酸的環(huán)肽，因?yàn)樗肿恿啃∫子诮咏[瘤部位，且呈環(huán)狀構(gòu)形不易被分解。Cy系列染料均能利用自身攜帶的活性基團(tuán)直接與環(huán)肽結(jié)合，部分此類探針檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在近紅外光學(xué)顯影和放射顯影在淺表的分辨率相似，但在深層組織中前者的信噪比更高。針對(duì)酶類研究一般是設(shè)計(jì)酶特異性熒光探針，這種與Cy系列染料結(jié)合的檢測(cè)技術(shù)除了在體內(nèi)定位時(shí)有顯著優(yōu)勢(shì)外，亦可作為體外檢測(cè)手段與一些常用技術(shù)結(jié)合，輔助確定組織中該酶的存在。

3. 與藥物載體結(jié)合(Conjugating to drug carriers)

現(xiàn)在生物可降解的、靶向性高的載體是藥學(xué)制劑領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)，而近紅外染料為研究這些載體的體內(nèi)行為提供了一種新思路。這些載體主體一般是由多聚谷氨酸、PGC等多聚物組成的骨架，骨架側(cè)鏈上有很多活性基團(tuán)，可以同時(shí)連接上數(shù)個(gè)靶向功能模塊和染料分子，所以在裝載藥物之前就可以先利用熒光顯影對(duì)該載體的靶向性等作出評(píng)價(jià)。這個(gè)領(lǐng)域的報(bào)道比較少，現(xiàn)在多選用結(jié)構(gòu)較小的單克隆抗體片段或葉酸這些小分子作為藥物載體上的靶向模塊與Cy系列染料、ICG衍生物等結(jié)合，進(jìn)一步完善對(duì)這些載體的研究可以為疾病確定和定位給藥帶來(lái)新的希望。

二、cy染料活化基團(tuán)的選擇

依需要標(biāo)記的抗原、抗體、酶、多肽等分子所帶的可標(biāo)記基團(tuán)的種類（氨基、醛基或巰基）以及分子的酸堿性，選擇相應(yīng)的活化染料和反應(yīng)條件。為減少空間位阻影響，可在cy染料與被標(biāo)記物之間加入交聯(lián)臂結(jié)構(gòu)。常見(jiàn)抗體、抗原、酶、多肽對(duì)應(yīng)的染料活化基團(tuán)如下：

1.標(biāo)記氨基的活化基團(tuán)：NHS ester (N-羥基丁二酰亞胺酯)。

2.標(biāo)記醛基的活化基團(tuán)：Hydrazide酰肼。多的用于神經(jīng)元細(xì)胞的電極失蹤和神經(jīng)縫隙連接研究

3.標(biāo)記巰基的活化基團(tuán)：Maleimide，馬來(lái)酰亞胺 

三、小動(dòng)物活體成像操作流程

以研究腫瘤靶向信號(hào)肽為例，介紹小動(dòng)物活體成像實(shí)驗(yàn)流程。本實(shí)驗(yàn)人工給小鼠接種皮下腫瘤，然后制備cy7-信號(hào)肽復(fù)合體（探針），通過(guò)尾靜脈注射小鼠，在不同時(shí)間點(diǎn)做活體成像分析，觀察cy7-信號(hào)肽復(fù)合體（探針）在體內(nèi)的特異性分布。

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物準(zhǔn)備（動(dòng)物模型建立）

1) SPF級(jí) BALB/C裸鼠，5～8 周齡，18～20克，自由進(jìn)食、水。飼養(yǎng)1周后接種細(xì)胞，分組或混編分籠飼養(yǎng)。12小時(shí)光照/日,明暗交替。相對(duì)濕度50%±10%、溫度23±2℃。

2) 細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)CNE-1細(xì)胞（實(shí)驗(yàn)室根據(jù)具體情況），取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，胰酶常規(guī)消化,離心，富集，利用無(wú)菌PBS清洗細(xì)胞，離心，富集，重復(fù)上述過(guò)程3次，zui后用無(wú)菌PBS液調(diào)整細(xì)胞濃度為l×10⁷個(gè)/ml，收集細(xì)胞于離心管內(nèi)。

3) 細(xì)胞接種取0.1ml CNE-1細(xì)胞懸浮液接種于每只小鼠的雙后肢大腿。根部皮下，雙后肢皮下注射相同腫瘤細(xì)胞數(shù)，每處1×10⁶個(gè)細(xì)胞。

4) 成瘤觀察繼續(xù)飼養(yǎng)，觀察細(xì)胞接種后的生長(zhǎng)狀況，大約5-6天后可見(jiàn)瘤塊，待約1-2 周后，腫瘤長(zhǎng)至約0.5-0.8cm直徑，開(kāi)始做體內(nèi)多肽靶向?qū)嶒?yàn)。

注意：1)動(dòng)物分組、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)設(shè)置；

2)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接種腫瘤后，注射熒光探針前，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康慕o藥或做其他處理。

2.標(biāo)記復(fù)合物制備

利用Cy7 NHS ester上琥珀酰亞胺基與信號(hào)肽末端以及側(cè)鏈氨基的反應(yīng)，將熒光分子Cy7 NHS ester連接到多肽上，形成Cy7-信號(hào)肽的熒光多肽復(fù)合物（探針）。

1) Cy7反應(yīng)液準(zhǔn)備。避光條件下,將1mg Cy7 NHS ester溶于200μL二甲基亞砜，終濃度5 mg/ml，20μl/管分裝，每離心管含Cy7 NHS ester 100 μg，用鋁箔紙包好，置于-80 ℃冰箱避光冷凍備用。

2) 帶標(biāo)記信號(hào)肽準(zhǔn)備。取2mg多肽，溶解于0.1 M NaHCO₃ 溶液，終濃度為1 mg/ml。

3) Cy-信號(hào)標(biāo)記復(fù)合物生產(chǎn)。按照信號(hào)肽:Cy7-NHS=7:1(molar ratio)的比例，混合信號(hào)肽溶液與Cy7-NHS 溶液，放置于恒溫震蕩反應(yīng)器中，室溫25℃避光震蕩反應(yīng)4小時(shí)（如圖1.）

4) 標(biāo)記復(fù)合物純化。用SephadexG-15凝膠柱純化、收集標(biāo)記復(fù)合物，低溫干燥濃縮。

注意：1）染料標(biāo)記復(fù)合物生成的反應(yīng)條件需根據(jù)待標(biāo)記大分子與熒光染料活性基團(tuán)具體進(jìn)行調(diào)整。

2）NHS用于標(biāo)記氨基，因此標(biāo)記復(fù)合物生成反應(yīng)溶液中需要除去帶氨基的成分，一般通過(guò)多次半滲透后濃縮的辦法把待標(biāo)記大分子溶液中的其他帶氨基成分去除。

3）標(biāo)記復(fù)合物的純化，需根據(jù)復(fù)合物的分子大小，理化及生物學(xué)性質(zhì)選擇合適方法。

圖1：cy NHS ester與氨基反應(yīng)形成標(biāo)記復(fù)合物

3. 活體內(nèi)靶向分布實(shí)驗(yàn)

1) 小鼠于成像前6小時(shí)開(kāi)始禁食，以降低因胃腸道食物引起的背景干擾。

2) 通過(guò)小鼠尾靜脈注射0.1ml Cy7-信號(hào)肽溶液（濃度1mg/mL），或Cy7標(biāo)記復(fù)合物稀釋后，于裸鼠尾靜脈注射200μL(濃度0.5 mg/mL)[*用量和時(shí)間需要客戶根據(jù)自己的儀器和藥物試劑等條件優(yōu)化]。對(duì)照組實(shí)驗(yàn)小鼠注射從尾靜脈注射游離cy7染料溶液（1mg/mL）0.1ml

3) 注射后，分別于1h、2h、15h、24h、48h后，用10%水合氯醛溶液按0.35ml/100mg體重腹腔注射麻醉小鼠（*次麻醉后應(yīng)給小鼠脫毛，減少毛發(fā)產(chǎn)生的背景熒光干擾），用膠帶固定在治療床上，根據(jù)腫瘤部位，采取合適體位(如圖2.)

4) 小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)分別對(duì)小鼠全身及腫瘤部位熒光掃描成像, Ex/Em(nm): 749/776。

5) 記錄動(dòng)物在體內(nèi)發(fā)射熒光的成像圖片，分析熒光復(fù)合物（探針、藥物）的分布情況。比較不同分組小鼠（陰性陽(yáng)性對(duì)照組）的熒光分布情況。

6) 成像結(jié)束后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，選擇是否要解剖裸鼠的心、肝、脾、肺、腎等臟器，進(jìn)行成像分析。

注意：

1) 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要通過(guò)尾靜脈注射、皮下移植、原位移植等方法接種細(xì)胞、組織或已標(biāo)記的探針。在建模時(shí)應(yīng)認(rèn)真考慮實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮?/span>cy染料（cy5, cy5.5, cy7）熒光波長(zhǎng)，建模時(shí)不宜接種深部臟器和觀察熒光，但可以觀察皮下瘤和解剖后臟器直接成像。深部臟器和體內(nèi)轉(zhuǎn)移的觀察大多選用熒光素酶標(biāo)記。

2) 不同cy染料活性部位可標(biāo)記不同基團(tuán)，確保反應(yīng)體系內(nèi)去除與待標(biāo)記基團(tuán)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合cy染料的試劑，本例中，用cy7 NHS ester標(biāo)記多肽氨基，應(yīng)通過(guò)半滲透等方法盡量去除反應(yīng)體系內(nèi)其他攜帶氨基的分子，避免攜帶cy7染料的物質(zhì)被注射進(jìn)小鼠體內(nèi)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

3) 本例中通過(guò)標(biāo)記探針與特異性靶點(diǎn)的結(jié)合改變熒光信號(hào)的體內(nèi)分布，在一些設(shè)計(jì)中，也可通過(guò)探針與靶點(diǎn)結(jié)合導(dǎo)致的空間位置改變，淬滅熒光信號(hào)。

圖2：注射標(biāo)記探針、麻醉、脫毛后的實(shí)驗(yàn)小鼠

圖3：注射cy-多肽標(biāo)記復(fù)合物的小鼠與對(duì)照組分別成像

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