高分辨率熔解曲線（HRM）分析指南

      HRM(High Resolution Melting analysis，高分辨熔解曲線)同許多熒光PCR技術(shù)一樣，是利用特定dsDNA染料可以插入DNA雙鏈小溝中（PCR產(chǎn)物）的特性，通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)升溫過(guò)程中dsDNA解鏈，熒光染料脫落，熒光信號(hào)減弱或消失的過(guò)程，高分辨記錄熔解曲線，從而對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。HRM技術(shù)利用dsDNA的物理性質(zhì)，準(zhǔn)確反映DNA序列堿基配對(duì)特異性與解鏈溫度變化的情況，無(wú)需使用特異性標(biāo)記探針，不受突變種類和突變位點(diǎn)的限制，具有高靈敏度和特異性、高通量、操作簡(jiǎn)單靈活、成本低等優(yōu)點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)證明，在PCR反應(yīng)前或反應(yīng)后加入飽和dsDNA染料，對(duì)HRM分析，效果相同。在PCR后加入，可閉管進(jìn)行HRM分析，無(wú)需凝膠電泳。HRM分析，不損傷PCR產(chǎn)物，用于HRM分析的PCR產(chǎn)物仍可用于電泳、膠回收、測(cè)序等一系列后續(xù)操作。HRM可應(yīng)用于核酸突變掃描、基因分型、甲基化檢測(cè)、短串聯(lián)重復(fù)序列分析、序列匹配和RNA編輯等多方面研究，已越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外核酸分子實(shí)驗(yàn)室的歡迎和重視。

      對(duì)于目前絕大多數(shù)的突變分析方法來(lái)說(shuō)，都很難鑒定出純合子序列突變。在一些不同種類的小的擴(kuò)增片段中，高分辨率熔解曲線則顯示出了鑒定純合子序列突變的能力，這種方法能鑒定出大多數(shù)的純合突變。HRM技術(shù)在遺傳學(xué)研究方面也帶來(lái)很大便利，只需在PCR反應(yīng)體系中加入雙鏈DNA飽和熒光染料，在PCR反應(yīng)之后再花15 分鐘，就可以完成96或384個(gè)樣品的DNA變異掃描。采用這種方法，當(dāng)片段的大小在400bp或者更小時(shí)，靈敏性zui高。

一、HRM分析條件

1. 設(shè)備

      PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線*取決于DNA堿基序列，序列中如有一個(gè)堿基發(fā)生突變，都會(huì)改變dsDNA的解鏈溫度。但是這種變化差異極小，只有零點(diǎn)幾攝氏度，HRM技術(shù)需要區(qū)分Tm值差異極小的樣品，以鑒別單個(gè)堿基的差異，因此，對(duì)溫度分辨率的要求相當(dāng)高，如果儀器的分辨率不高，是無(wú)法檢測(cè)的?？组g溫度差異（溫度均一性：Tm的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.020～0.264℃），孔間溫度均一性要達(dá)到0.264℃以內(nèi)才能保證HRM分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。熔解速率，zui低要求0.1℃/秒。數(shù)據(jù)密度，zui低要求10個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)/℃。目前市場(chǎng)上HRM分析儀器的供應(yīng)商，有專門用于HRM分析的儀器，也有附帶HRM功能的Real Time PCR儀。這些廠家包括：Roche, QIAGEN, Idaho Technology。市場(chǎng)上認(rèn)可度較高的一些設(shè)備包括: HR-1、LightScanner-32、LightScanner-96和LightScanner-384(Idaho Technology Inc)，可采集55～95℃的熒光信號(hào)，變溫速率是0.02～0.1℃／s，每秒鐘可以采集200個(gè)數(shù)據(jù)資料。LightCycler 480s(Roche Diagnostics, Germany)和Rotor-Gene6000(Corbett)等傳統(tǒng)實(shí)時(shí)定量PCR儀加裝高分辨率熔解模塊后，采用qPCR-HRM方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目的核酸片段的定量和定性檢測(cè)。

2. 染料

      進(jìn)行HRM分析的另一個(gè)必要條件是飽和染料。用于HRM分析的染料必須滿足兩個(gè)條件。首先，必須是飽和染料。所謂飽和染料是指染料必須能飽和結(jié)合于DNA雙鏈所有小溝位置，也就是染料相對(duì)于dsDNA要相對(duì)過(guò)量，以使dsDNA沒(méi)有更多位置結(jié)合染料，在dsDNA升溫解鏈時(shí)，飽和染料從雙鏈上脫落，熒光信號(hào)同步減弱，準(zhǔn)確反應(yīng)出樣品熔解溫度（Tm）、熔解曲線的不同（如圖1-A）。SYBR Green I染料廣泛用于qPCR，但屬于非飽和染料，不能封閉dsDNA的所有小溝位置，遠(yuǎn)未將DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中的小溝飽和。這樣，DNA雙鏈高溫逐步變性時(shí)，部分熒光染料分子會(huì)隨機(jī)結(jié)合到尚未解鏈的雙鏈DNA空置的小溝位置，染料分子發(fā)生重排，造成熒光信號(hào)混亂，特異性下降，不能準(zhǔn)確反映dsDNA解鏈過(guò)程（如圖1-B）

圖1：dsDNA解鏈前后熒光染料結(jié)合情況。A(左圖):飽和染料在dsDNA解鏈時(shí)，熒光分子同步脫落，信號(hào)減弱。B(右圖):不飽和染料在dsDNA解鏈時(shí)，熒光分子重新結(jié)合于未解鏈的dsDNA部位，熒光信號(hào)沒(méi)有變化，不能反應(yīng)樣品熔解溫度(Tm)。

       其次，染料不能抑制PCR反應(yīng)。SYBR Green I染料不是飽和染料，加大染料濃度，不但不能飽和結(jié)合dsDNA小溝位置，還會(huì)抑制PCR反應(yīng)進(jìn)行，造成擴(kuò)增反應(yīng)無(wú)序，混亂。

      用于HRM分析熒光染料如LC Green, Ly Green, eva Green等均為飽和染料，能飽和結(jié)合于PCR反應(yīng)產(chǎn)物的雙鏈小溝內(nèi)，同時(shí)這些染料不會(huì)抑制PCR反應(yīng)。Ly Green為2015年推出的HRM分析染料，除具有飽和染料、不抑制PCR等特點(diǎn)外，熒光信號(hào)穩(wěn)定、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好時(shí)期突出優(yōu)點(diǎn)（如圖2）。

圖2. LyGreen染料用于綿羊FecB基因HRM分析.

HRM分析設(shè)備為L(zhǎng)ightCycler@480熒光定量PCR儀(德國(guó)羅氏)

二、HRM分析流程

1. 引物設(shè)計(jì)合成

       據(jù)基因序列應(yīng)用Oligo軟件設(shè)計(jì)、合成正向引物，反向引物（或依據(jù)參考文獻(xiàn)）。將引物稀釋成10mmol/L的工作濃度,-20℃保存?zhèn)溆谩?/span>

2. 反應(yīng)體系

注：1）50µL反應(yīng)，根據(jù)引物及擴(kuò)增DNA長(zhǎng)度不同，可進(jìn)行優(yōu)化。

2）染料在反應(yīng)前加入或反應(yīng)后加入對(duì)反應(yīng)影響不大，反應(yīng)前加入，可實(shí)現(xiàn)閉管操作。

3. 擴(kuò)增及HRM程序

三、HRM分析局限性及解決辦法

1. 熔解設(shè)備自身溫差。在所有的熔解系統(tǒng)中，孔與孔之間都存在微小的溫度差異，故影響檢測(cè)的靈敏性。如果孔與孔間的溫度差異為0.1℃，則zui終的樣品熔解溫差也可能是0.1℃。因此，HRM對(duì)儀器溫度的均一性要求非常高。為解決這一問(wèn)題，可以在PCR體系中加入2種溫度內(nèi)標(biāo)，低溫時(shí)熔解和高溫時(shí)熔解。HRM儀上的分析軟件可以根據(jù)這2種內(nèi)標(biāo)的熔解峰在熔解曲線中的位置來(lái)糾正孔與孔之間的溫度差異，可顯著提高檢測(cè)的靈敏性。

2. PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。PCR反應(yīng)體系中，核酸模板質(zhì)量要經(jīng)過(guò)檢測(cè)，濃度要均一。在分析多樣本時(shí)，模板外的其他共同組分要先混合均勻后，再分別加入樣品模板，以保證反應(yīng)體系的均一性。若在PCR反應(yīng)后加入飽和熒光染料，通常不需要對(duì)反應(yīng)條件做任何改變；若在PCR反應(yīng)前加入染料，可以實(shí)現(xiàn)真正的閉管操作，避免污染。但此時(shí)需要對(duì)原來(lái)的反應(yīng)條件做一定的改變，通常需要增加Mg2+濃度2～3 mmol/L，增加退火溫度1～5℃。隨著Mg2+濃度的增加，Tm值也會(huì)升高，當(dāng)Tm值超過(guò)熔解設(shè)備所允許的zui高溫度時(shí)，還需要加入二甲基亞砜DMSO(10％)或甜菜堿(0.5 mol/L)來(lái)降低Tm值。在某些情況下，為快速找到反應(yīng)體系z(mì)ui適的退火溫度，需要做梯度PCR試驗(yàn)。在PCR反應(yīng)程序的zui后，一定要加入解鏈和退火的步驟，以增加PCR產(chǎn)物的雜合度，提高試驗(yàn)的分辨率和準(zhǔn)確度。

3. 引物的二聚體。PCR產(chǎn)物高純度的PCR特異性產(chǎn)物是獲得HRM分析結(jié)果較高特異性的前提，在PCR引物設(shè)計(jì)時(shí)，一定要避免引物的二聚體和發(fā)卡結(jié)構(gòu)，盡量降低基因組其他片段的非特異性結(jié)合。根據(jù)所用擴(kuò)增酶的情況，要嚴(yán)格控制PCR反應(yīng)的循環(huán)數(shù)，以降低非特異性擴(kuò)增增加的風(fēng)險(xiǎn)。根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康?，要?yán)格控制擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度。試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著擴(kuò)增片段長(zhǎng)度的增加，HRM結(jié)果的靈敏度和特異性會(huì)降低，當(dāng)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為400-1000 bp時(shí)，檢測(cè)的靈敏度為96.1％，異性為99.4％。對(duì)于一些差異只有1-2 bp的基因片段進(jìn)行分型時(shí)，需要借助探針才能解決。擴(kuò)增子不能太長(zhǎng)，當(dāng)檢測(cè)大片段如整個(gè)外顯子或內(nèi)含子的突變位點(diǎn)時(shí)，就要使用多對(duì)引物，將大片段分別擴(kuò)增檢測(cè)。同其他任何基于PCR反應(yīng)的突變檢測(cè)一樣，HRM不能檢測(cè)外顯子、內(nèi)含子或整個(gè)基因等大片段的缺失突變。

4. 轉(zhuǎn)換純合突變子檢測(cè)。目的片段突變或多態(tài)位點(diǎn)的類型在轉(zhuǎn)換、顛換、插入和缺失4大類堿基突變類型中，雜合突變子產(chǎn)生的Tm值差異zui大，顛換純合突變子的Tm值差異在0.8～1.4℃之間，HRM技術(shù)可以對(duì)其準(zhǔn)確分型。但轉(zhuǎn)換純合突變子產(chǎn)生的Tm值差異通常小于0.4℃，HRM技術(shù)不能對(duì)其準(zhǔn)確分型，此時(shí)需要采用小片段法或非標(biāo)記探針?lè)?。使用小片段法時(shí)，片段長(zhǎng)度一般設(shè)計(jì)為40～90 bp，包含1個(gè)SNP位點(diǎn)為宜。使用探針?lè)〞r(shí)，熔解曲線上會(huì)出現(xiàn)2個(gè)峰圖，可以進(jìn)行2次SNPs分析，且探針與其互補(bǔ)區(qū)結(jié)合形成的雙鏈部分更短，更能增加試驗(yàn)的靈敏度，從而增加對(duì)純合突變子的分型準(zhǔn)確性。

5. 樣品的提取方法一致。樣品基因組提取方法樣品基因組不同的提取方法會(huì)對(duì)PCR后產(chǎn)物熔解曲線的形狀和分析結(jié)果產(chǎn)生很大的影響，因此，待分析樣品的提取方法要一致。為找出較為合適的提取方法，實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)自身?xiàng)l件設(shè)計(jì)不同基因組提取方法對(duì)HRM結(jié)果影響的試驗(yàn)，找到較為理想的提取方法或較為理想的基因組提取試劑盒。

6. 飽和熒光染料的差異LC-Green、Syt09、ResoLight Dye和Ly Green,等飽和熒光染料的性質(zhì)差異不大，可以相互替代，試驗(yàn)時(shí)只需要對(duì)PCR緩沖液和反應(yīng)條件做微小的調(diào)整即可。SYBR Green I染料為非飽和熒光染料，在檢測(cè)核酸微小變異時(shí)存在缺陷，因此一些研究者們不建議采用。

四、HRM技術(shù)展望

HRM技術(shù)具有高通量、高靈敏度和特異性、操作簡(jiǎn)單靈活、成本低、對(duì)DNA分子無(wú)損害、閉管操作等諸多優(yōu)點(diǎn)。在畜牧業(yè)方面，通過(guò)對(duì)畜禽基因組突變位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)性分析和連鎖性分析，HRM技術(shù)可以鑒定出更多的與畜禽特定經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的SNPs位點(diǎn)，增加畜禽參考群育種值估計(jì)的準(zhǔn)確性，還可以增加畜禽分子疾病的檢出率，并為其遺傳疾病和基因突變所致疾病的分子診斷提供革命性手段。在農(nóng)業(yè)方面，HRM技術(shù)將增加作物遺傳標(biāo)記位點(diǎn)的密度，加快作物高產(chǎn)、抗逆性等優(yōu)良性狀的改良進(jìn)度。隨著消費(fèi)者食品安全意識(shí)的增強(qiáng)和行業(yè)競(jìng)爭(zhēng)的日趨激烈，對(duì)食品微量成分種類和含量的檢測(cè)日益重要，HRM技術(shù)因其較高的靈敏度和特異性，必將發(fā)展成為一種可靠便捷的檢測(cè)手段。在人類疾病的診斷方面，HRM技術(shù)必已經(jīng)從試驗(yàn)研究走向臨床診斷，成為人類分子疾病臨床診斷的新手段。因此，HRM技術(shù)的應(yīng)用范圍將會(huì)進(jìn)一步拓寬，并越來(lái)越受到核酸研究者的重視。

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